Основные методы исследования бактериологического материала. Характеристика бактериологического метода исследования. Фазы развития бактериальной популяции

ЗАНЯТИЕ № 4

ТЕМА: ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ (КУЛЬТУРАЛЬНЫЙ) МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ. БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МИКРООРГАНИЗМОВ.

ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ

Питание бактерий. Питательные вещества – источники углерода и азота. Классификация бактерий по типам питания Аутотрофы и хемоорганотрофы

Факторы роста и их источники. Источники минеральных элементов.

Способы и механизмы переноса питательных веществ через мембрану.

Энергетические потребности бактерий. Пути получения энергии у аутотрофов (фотосинтез, хемосинтез). Источники и пути получения энергии у хемоорганотрофов.

Аэробный и анаэробный типы биологического окисления у бактерий. Аэробные, анаэробные, факультативно анаэробные и микроаэрофильные бактерии. Способы создания анаэробных условий.

Задачи, этапы, преимущества и недостатки бактериологического (культурального) метода исследования.

Рост и размножение микроорганизмов. Способы размножения. Бинарное (простое) деление, механизм. Размножение бактериальных популяций.

Принципы и методы культивирования бактерий. Питательные потребности микробов.

Питательные среды для культивирования бактерий. Требования к питательным средам. Классификация питательных сред.

Условия и техника культивирования бактерий. Техника посева на питательные среды. Закономерности и характер роста бактерий на плотных и жидких питательных средах.

Способы выделения чистых культур аэробных и анаэробных бактерий.

Свойства, используемые для идентификации выделенных культур.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ И ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Бактериологический метод (этапы):

1 1-й этап выделения чистой культуры аэробных бактерий: А) Микроскопия патологического материала.

Окраска мазков из патологического материала по Граму. Зарисовка препарата.

Посев патологического материала бактериологической петлей на пластинчатый мясопептонный агар (МПА) для получения изолированных колоний.

Классификация питательных сред (указать области применения)

1. По консистенции: жидкие (мясо- пептонный бульон, желчный, сахарный бульон), плотные (2- 3% агара) и полужидкие (0,15- 0,7 % агара) среды.

2. По происхождению: естественные - из молока, мяса. яиц, картофеля, сыворотки крови человека, животных и др продуктов; искусственные – 1) натуральные сбалансированные смеси питательных веществ в концентрациях и сочетаниях, необходимых для роста и размножения микроорганизмов, универсальный источник азота и углерода - пептоны - продукты неполного расщепления белков с помощью пепсина или различные гидролизаты (рыбный, казеиновый, дрожжевой и др.).2) синтетические c точным химическим составом Сотона для микобактерий, 199 для клеток.

3. По составу: простые питательные среды (мясо- пептонный бульон- МПБ, мясо- пептонный агар- МПА) и с ложные (КА = МПА +5- 10% крови животных)

4. По назначению:

А) Общего назначения - универсальные, предназначенные для культивирования любых микроорганизмов (МПА,КА)

Б) Специальные для выращивания микроорганизмов не растущих на универсальных средах, дифференциации видов и избирательного выделения отдельных видов микроорганизмов:

элективные (селективные) для выделения определенных видов микроорганизмов и подавления роста сопутствующих – (солевой агар для стафилококков).

дифференциально-диагностические (ДДС) -среды, позволяющие различать виды бактерий по ферментативной активности; Они с одержат: 1) универсальную питательную среду (МПА, КА); 2)дифферецирующий фактор - химический субстрат (например, углевод), различное отношение к которому является диагностическим признаком для данного микроба.3) Индикатор, изменение цвета которого свидетельствует о биохимической реакции. (среды Эндо, Плоскирева, Гисса и другие).

дифференциально-селективные (ДС) - среды, позволяющие выделять бактерии определенного вида по их физиологическим особенностям и дифференцировать от других видов по ферментативной активности Они содержат: 1) МПА 2) элективный химический субстрат, препятствующий росту других видов бактерий . 3)дифферецирующий фактор - субстрат, отношение к которому является диагностическим признаком для данного микроба;) 4.) Индикатор, изменение цвета которого свидетельствует о биохимической реакции. (среды ЖСА для стафилококков, ВСА для сальмонелл, Плоскирева для шигелл и сальмонелл).

В) Обогащения среды для размножения и накопления бактерий определенного вида в клиническом материале (кровь в 20% желчном бульоне =сальмонеллы, отделяемое зева в 10 % сывороточном+ 2 % теллурита = коринебактерии.)

Г) Транспортные среды для забора и доставки (консервации) клинического материала =48 часов (Среда Амиеса –полужидкий агар+уголь активированный).)

Питательные среды (примеры):

Среда Эндо Тип среды дифференциально-диагностическая для энтеробактерий Питательная основа МПА Дифференцирующий фактор лактоза 1% Индикатор основной фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия. Е.с oli разлагают лактозу до кислоты –колонии красные с металлическим блеском, патогенные бесцветные;

Солевой агар Тип среды элективная для выделения стафилококков Питательная основа МПА Элективный фактор хлористый натрий 10%

Среда Плоскирева Тип среды дифференциально-селективная для энтеробактерий

Питательная основа МПА Элективный фактор соли желчных кислот Дифференцирующий фактор лактоза

Индикатор нейтральный красный

Желточно-солевой агар Тип среды дифференциально-селективная для S . aureus _

Питательная основа МПА Элективный фактор хлористый натрий 10%

Дифференцирующий фактор яичный желток

Индикатор нет

2 2 этап бактериологического метода исследования (выделение чистой культуры):

А) Изучение изолированных колоний (эшерихий, стафилококка) на пластинчатом МПА.

Б) Приготовление мазков из отобранных колоний (окраска по Граму).

В) Пересев изолированных колоний на скошенный МПА для накопления чистой культуры.

3 Выделение чистой культуры анаэробных бактерий: посев суспензии почвы на среду Китта-Тароцци для выделения патогенных клостридий

Среда Китт- Тароцци состоит из питательного бульона, 0,5% глюкозы и кусочков печени или мясного фарша для поглощения кислорода из среды. Перед посевом среду прогревают на кипящей водяной бане в течение 20 - 30 минут для удаления воздуха из среды. После посева питательную среду сразу заливают слоем парафина

Методы создания анаэробиоза:

1.Физический- откачивание воздуха, введение специальной газовой безкислородной смеси (чаще- N 2 - 85%, CO 2 - 10%, H 2 - 5%), предварительное кипячение питательных сред, посев в глубокий столбик агара, заливка сред вазелиновым маслом для сокращения доступа кислорода, использование герметически закрывающихся флаконов и пробирок, шприцев и лабораторной посуды с инертным газом, использование плотно закрывающихся эксикаторов с горящей свечой

2. Химический- применяют химические поглотители кислорода.

3. Биологический - совместное культивирование строгих аэробов и анаэробов (аэробы поглощают кислород и создают условия для размножения анаэробов – метод Фортнера).

Среда Китт - Тароцци состоит из питательного бульона, 0,5 % глюкозы и кусочков печени или мясного фарша для поглощения кислорода из среды. Перед посевом среду прогревают на кипящей водяной бане в течение 20 - 30 минут для удаления воздуха из среды. После посева питательную среду сразу заливают слоем парафина или вазелинового масла для изоляции от доступа кислорода.

4. Смешанный - используют несколько разных подходов.

Используются специальные приборы для создания анаэробных условий - анаэростаты. В настоящее время наиболее простым и эффективным оборудованием для создания анаэробных и микроаэрофильных условий является химический метод со специальными пакетами, действующими по принципу поглощения атмосферного кислорода в герметически закрытых емкостях .

Среда Вильсона-Блера (пробирки,чашки):

Питательная основа МПА Дыхательный субстрат глюкоза

Редуцирующий фактор сульфит натрия и двуххлористое железо сульфит-натрия Na 2 SO 3 → Na 2 S

Для среды Вильсона - Блера базой является агар с добавлением глюкозы , Клостридии образуют на этой среде колонии чёрного цвета за счет восстановления сульфита до сульфид - аниона , который соединяясь с катионами железа (II) дает соль чёрного цвета. Как правило, черные на этой среде образования колонии , появляются в глубине агарового столбика .

Тиогликолевая среда (среда для контроля стерильности): (пробирки):

Питательная основа МПБ Дыхательный субстрат глюкоза Редуцирующий фактор тиогликолят натрия

Индикатор резазурин

Глюкозо-кровяной агар Цейсслера: (чашки): Питательная основа МПА, кровь

Дыхательный субстрат глюкоза Редуцирующий фактор гемоглобин

Термин «анаэробы» ввел Луи Пастер , открывший в 1861 году бактерии маслянокислого брожения .

А Лекция 3 Физиология микроорганизмов. Метаболизм бактерий .

Физиология микроорганизмов включает:

типы питания;

типы дыхания;

культивирование (условия, среды, характер и скорость роста);

биохимическую активность;

изменчивость;

выделение биологически активных веществ, токсинов и других факторов патогенности;

чувствительность к антибиотикам, бактериофагам, бактериоцинам;

другие биологические свойства.

Метаболизм бактерий – совокупность физико-химических процессов (химических превращений и реакций), направленных на воспроизводство структур и обеспечение жизненных функций микробной клетки, таких как:

рост и размножение;

отложение резервного пищевого материала;

транспорт питательных веществ в микробную клетку;

выделение продуктов метаболизма (токсинов, ферментов, антибиотиков и других биологически активных веществ);

движение;

спорообразование;

адгезия на чувствительных рецепторах клеток хозяина и проникновение в них;

различных адаптивных реакций на изменение внешней среды.

Анаболизм - совокупность биохимических реакций, осуществляющих синтез компонентов клетки.

Катаболизм - совокупность реакций, обеспечивающих клетку энергией.

Схема изучения метаболизма – этапы:

1. Начальный (периферический) метаболизм – проникновение веществ в клетку извне и распад до промежуточных продуктов.

2. Амфиболизм (промежуточный метаболизм) – образование промежуточных продуктов метаболизма, общих для катаболических и анаболических путей.

3. Конечные, строго специализированные этапы конструктивного метаболизма (ведут к построению структур клетки) и энергетического метаболизма (образование АТФ).

Механизмы проникновения питательных веществ в клетку:

Простая диффузия (для истинных растворов). Энергонезависимый процесс.

Облегченная диффузия («паром по течению») – в направлении градиента концентрации с участием белков – переносчиков. Энергозависимый процесс.

Активный транспорт – против концентрационного и электрохимического градиента с участием пермеаз (амино-, оксикислотных, ионных и др.). Процесс идет с затратой энергии АТФ, зависит от заряда веществ и их трансформации в процессе переноса.

Микроорганизмы по способности усваивать источники углерода делятся на две группы: автотрофы (лат. autos - сам,trophe - питание) синтезируют все углеродсодержащие компоненты клетки из СО 2 как единственного источника углерода и гетеротрофы (лат.heteros - другой, «питающийся за счет других») используют разнообразные органические углеродсодержащие соединения.

В зависимости от источников энергии и микроорганизмы подразделяют на фототрофы (фотосинтезирующие), способные использовать солнечную энергию, и хемотрофы (хемосинтезирующие), получающие энергию за счет окислительно-восстановительных реакций.

В зависимости от используемых доноров электронов бактерии разделяют на литотрофы (используют неорганические доноры электронов) и органотрофы (используют органические соединения).

Прототрофы - микроорганизмы, способные синтезировать все необходимые им органические соединения из глюкозы и солей аммония.

Ауксотрофы - микроорганизмы, не способные синтезировать какие-либо органические соединения. Они получают эти соединения в готовом виде из окружающей среды или организма человека.

Ферменты (от греч.fermentum-закваска) -высокоспецифические белковые катализаторы, присутствующие во всех живых клетках, без которых не возможны жизнь и размножение. Ферменты распознают соответствующие им метаболиты (субстраты), вступают с ними во взаимодействие и ускоряют химические реакции. Ферменты являются белками.

Ферментный состав микроорганизма определяется геномом и является достаточно стабильным признаком. Определение ферментов широко применяется для биохимической идентификации бактерий.

Эндоферменты катализируют метаболизм проходящий внутри клетки.

Экзоферменты выделяются клеткой в окружающую среду.

Конститутивные ферменты постоянно синтезируются в определенных концентрациях.

Индуцибельные ферменты – это ферменты, концентрация которых увеличивается при поступлении соответствующего субстрата.

Ферменты агрессии: гиалуронидаза, фибринолизин, нейраминидаза, коллагеназа, лецитиназа (лицитовителлаза), коагулаза, уреаза, аминокислотные декарбоксилазы, дезоксирибонуклеаза.

Культивирование – получение культур микроорганизмов в условиях искусственной питательной среды.

Цели культивирования:

получение чистых культур патогенных микроорганизмов и их идентификация;

накопление биомассы продуцентов БАВ (витаминов, гормонов, аминокислот, антибиотиков и др.);

получение диагностических и профилактических препаратов (вакцин, диагностикумов);

хранение эталонных музейных культур;

в санитарной микробиологии для определения санитарно-показательных микроорганизмов – индикаторов загрязненности окружающей среды.

Культура – популяция микроорганизмов, выращенная на питательной среде.

Чистая культура – популяция одного вида микроорганизмов, выращенная из изолированной колонии на питательной среде.

Большинство патогенных микробов выращивают на питательных средах при температуре 37°С в течение 1-2 сут.

Классификация питательных сред

По консистенции: жидкие, полужидкие, плотные.

По происхождению: естественные (молоко, картофель), искусственные, полусинтетические, синтетические

По составу: простые (МПА, МПБ, овощи, молоко), сложные (1% глюкозы, 10-20% сыворотки крови, 20-30% асцитической жидкости,5-10% дефибринированной крови).

По назначению:

универсальные - среды, на которых хорошо растут многие виды бактерий. К ним относятся мясо-пептонный бульон (МПБ) и мясо-пептонный агар (МПА);

специальные - среды, специально приготовленные для получения роста бактерий, которые не растут на универсальных средах;

дифференциально-диагностические - среды, позволяющие отличать одни виды бактерий от других по ферментативной активности;

селективные - среды, содержащие вещества, используемые микроорганизмами определенных видов и препятствующие росту других микроорганизмов. Селективные среды позволяют направленно отбирать из исследуемого материала определенные виды бактерий;

дифференциально-селективные - среды, сочетающие в себе свойства дифференциально-диагностических и селективных сред;

консервирующие;

обогатительные.

Размножение бактерий на жидких и плотных питательных средах.

Рост координированное воспроизведение всех компонентов бактериальной клетки и увеличение ее биомассы.Размножение – воспроизводство и увеличение количества клеток, приводящее к образованию бактериальной популяции.

Бактерии характеризуются высокой скоростью размножения. Скорость размножения зависит от видовой принадлежности, состава питательной среды, рН, температуры, аэрации.

На плотных питательных средах бактерии образуют скопления клеток, называемые колониями. Колонии разных видов отличаются по размерам, форме, консистенции, окраске, характеру краев, характеру поверхности, прозрачности.

Характер роста на жидких питательных средах: пленочный (образованием пленки на поверхности питательной среды), диффузное помутнение, придонный (образование осадка).

Фазы развития бактериальной популяции

Исходная стационарная фаза (~ 1-2 ч.). Число бактерий не увеличивается, клетки не растут.

Лаг-фаза или фаза задержки размножения (~ 2ч.).

Log-фаза - логарифмическая или экспоненциальная фаза (~ 3-5ч). Популяция делится с максимальной скоростью и идет увеличение особей в геометрической прогрессии.

Фаза отрицательного ускорения (~ 2ч.). Связана с истощением лимитирующего метаболита или накоплением токсических продуктов метаболизма.

Стационарная фаза максимума. Количество образующихся и отмирающих клеток одинаково.

Фаза ускоренной гибели (~ 3 ч.).

Логарифмическая фаза гибели (~ 5).

Фаза уменьшения скорости отмирания – остающиеся живые особи переходят в состояние покоя.

Энергетический метаболизм бактерий

Аэробы - микроорганизмы, использующих аэробный (окислительный) тип биологоческого окисления субстратов. Метаболизм аэробов осуществляется только при наличии в среде обитания высокой концентрации свободного кислорода, который выполняет функцию конечного акцептора отнятых от субстрата электронов. Культивирование аэробов осуществляют на средах с полным доступом кислорода воздуха.

Облигатные анаэробы - микроорганизмы, использующая анаэробный тип биологического окисления (брожение). Метаболизм осуществляется только в средах с низким окислительно-востановительным потенциалом при отсутствии кислорода.

Повышение концентрации кислорода в среде ведет к гибели вегетативных форм.

Количество извлекаемой в процессе брожения энергии невелико, поэтому облигатные анаэробы вынуждены сбраживать большое количество субстрата.

Факультативные анаэробы - микроорганизмы, способные извлекать энергию из субстратов аэробным (окислительным) и анаэробным (бродильным) путями биологического окисления. Метаболизм может осуществляться как в условиях полного доступа кислорода в среду, так и в условиях анаэробиоза.

Методы создания анаэробиоза

Физические

посев в столбик сахарного МПА;

кипячение (регенерация) жидких питательных сред с последующим масляным покрытием;

механическое удаление кислорода в анаэростатах;

замена кислорода индиферентным газом;

трубки Вейона-Виньяля.

Химические

аппарат Аристовского;

свеча Омелянского (щелочной р-р пирогаллола);

использование химических акцепторов кислорода: глюкозы, пировиноградной кислоты, муравьинокислого натрия и др.

Биологические

среда Китта-Тароцци

метод Фортнера

Анаэробы - организмы, получающие энергию при отсутствии доступа кислорода путем субстратного фосфорилирования , конечные продукты неполного окисления субстрата при этом могут быть окислены с получением большего количества энергии в виде АТФ в присутствии конечного акцептора протонов организмами, осуществляющими .

Анаэробное дыхание - совокупностьбиохимических реакций , протекающих в клетках живых организмов при использовании в качестве конечного акцептора протонов некислорода , а других веществ (например,нитратов ) и относится к процессамэнергетического обмена (катаболизм ,диссимиляция ), которые характеризуютсяокислением углеводов ,липидов иаминокислот до низкомолекулярных соединений.

Аэробные и анаэробные бактерии предварительно идентифицируются в жидкой питательной среде по градиенту концентрации O2:

1. Облигатные аэробные (нуждающихся в кислороде) бактерии в основном собираются в верхней части пробирки, чтобы поглощать максимальное количество кислорода. (Исключение: микобактерии - рост пленкой на поверхности из-за восколипидной мембраны.)

2. Облигатные анаэробные бактерии собираются в нижней части, чтобы избежать кислорода (либо не дают роста). 3.Факультативные бактерии собираются в основном в верхнем (окислительное фосфорилирование является наиболее выгодным, чем гликолиз), однако они могут быть найдены на всем протяжении среды, так как от O 2 не зависят. 4. Микроаэрофилы собираются в верхней части пробирки, но их оптимум - малая концентрация кислорода. 5.Аэротолерантные анаэробы не реагируют на концентрации кислорода и равномерно распределяются по пробирке.

Для измеренияпотенциала средыМ. Кларк предложил использовать величину pH20 - отрицательныйлогарифм парциального давления газообразноговодорода . Диапазон характеризует все степени насыщения водного раствора водородом и кислородом. Аэробы растут при более высоком потенциале , факультативные анаэробы , а облигатные - при наиболее низком .)

Классификация анаэробов , различают:

Факультативные анаэробы

Капнеистические анаэробы и микроаэрофилы

Аэротолерантные анаэробы

Умеренно-строгие анаэробы

Облигатные анаэробы

Если организм способен переключаться с одного метаболического пути на другой (например, с анаэробного дыхания на аэробное и обратно), то его условно относят к факультативным анаэробам .

До 1991 года в микробиологии выделяли класс капнеистических анаэробов, требовавших пониженной концентрации кислорода и повышенной концентрации углекислоты (Бруцеллы бычьего типа - B. abortus)

Практическое занятие №2.

Тема: Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний.

Цель: Изучить методы выделения чистых культур бактерий и овладеть бактериологическим методом диагностики инфекционных заболеваний.

Вопросы для самоподготовки:

1.Правила забора и транспортировки исследуемого материала для бактериологического исследования.

2Правила оформления направления на бактериологическое исследование.

3.Методы выделения чистых культур микроорганизмов.

4.Бактериологический метод диагностики. Цель. Этапы. Диагностическая ценность.

Основные понятия темы.

Бактериологический метод является основным методом диагностики инфекционных заболеваний. Его сущность – определение вида возбудителя инфекции, следовательно, на основании результатов бактериологического метода можно поставить этиологический (окончательный) диагноз. Основным недостатком метода является длительность исследования – от 3 до 5 суток, а в отдельных случаях и более.

Успех проведения бактериологического метода во многом зависит от предварительного этапа, включающего забор исследуемого материала и его транспортировку, оформление направления в бактериологическую лабораторию. При этом необходимо соблюдение ряда правил.

Забор исследуемого материала необходимо провести до начала антибактериальной терапии или через 8-10 часов после введения последней дозы . Чтобы избежать загрязнения пробы микрофлорой окружающей среды необходимо соблюдать строжайшую асептику. Для этого использовать стерильный материал: а) ватные тампоны для взятия материала из раны, со слизистых оболочек (глаз, зева, носа); б) проволочную петлю для материала из влагалища, анального отверстия; в) шприц для взятия крови, гноя; г) стерильную посуду для непосредственного сбора в нее мочи, мокроты, испражнений. Транспортировку полученного материала следует производить в максимально короткие сроки (2-3 часа) в специальных биксах или пеналах. Направление прилагают к клиническому образцу в качестве сопроводительного документа. Оно содержит основные сведения, необходимые для проведения микробиологического исследования:

фамилия, имя, отчество, возраст пациента; предполагаемый диагноз заболевания; предшествующая антимикробная терапия; характер материала; дата и время взятия материала; цель исследования; название лечебного учреждения, номер отделения, палаты; подпись лечащего врача.

Бактериологический метод осуществляется в два этапа (рис.2.1.):

Выделение чистой культуры возбудисуток); Идентификация чистой культуры (1-3 суток).

На первом этапе проводится посев исследуемого материала на твердую или в жидкую питательную среду, оценка культуральных свойств, отбор подозрительных колоний и их отсев на скошенный агар. Этап идентификации включает обязательное изучение , свойств и структуры выделенной чистой культуры, а также проведение дополнительных исследований по определению антибиотикочувствительности, фагочувствительности, фаготипирования, изучения патогенности и персистентных свойств.

Самостоятельная работа студентов на занятии.

Работа 1

Цель: Освоить бактериологический метод диагностики.

Задача. В бактериологическую лабораторию поступил исследуемый материал (испражнения) от больного с предварительным диагнозом: «Пищевая токсикоинфекция?». При микроскопии материала обнаружены грамположительные кокки и грамотрицательные палочки.

Выделите чистые культуры микроорганизмов, проведите их идентификацию. Определите этиологию пищевой токсикоинфекции.

Методика:

Все этапы бактериологического метода условно осуществляются в течение одного занятия: студент выполняет манипуляции очередного этапа, относит материал в термостат и сразу получает готовый результат для выполнения следующего этапа исследования.

1. Посев исследуемого материала на агар в чашке Петри методом механического разобщения с целью получения отдельных колоний (1-ый день).

Простерилизованной в пламени горелки и охлажденной петлей берут материал для посева и вносят в чашку, слегка приоткрыв крышку. На поверхности питательной среды материал распределяют петлей следующим образом: у края чашки частыми штрихами образуют овальную площадку, на которой остается значительная часть материала, затем проводят параллельные штрихи на расстоянии 0,5 см от одного края чащики к другому. При посеве петлю следует держать параллельно агару, чтобы не царапать его (рис.2.2.а). После рассева петлю вынимают из чашки и немедленно обжигают в пламени, одновременно закрывая чашку Петри крышкой. Чашку маркируют и помещают вверх дном в термостат на сутки.

2.Изучение культуральных свойств выросших колоний (2-ой день).

Через сутки при правильном посеве на последних штрихах вырастают отдельные колонии (рис.2.2.б). Дифференцируют разные типы колоний по величине, цвету (Рис. 2.3.а), форме, прозрачности, характеру поверхности (гладкая, шероховатая) и края (ровный, зазубренный) (рис.2.3.б). Из материала части колоний готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют. Остаток изучаемой колонии отсевают петлей в пробирку на скошенный питательный агар для получения чистой культуры. Посев ставят в термостат на сутки.

3. Идентификация выделенной чистой культуры (3-ий день).

Через сутки выросшую чистую культуру идентифицируют по основным видовым признакам. Изучают морфологию при микроскопии мазка из чистой культуры. Осуществляют посев чистой культуры на тест-системы (стафитест, энтеротест) для изучения активности. Для этого готовят 1-миллиардную взвесь бактерий в физиологическом растворе, затем дозаторными или пастеровскими пипетками вносят 0,1 мл взвеси в лунки тест-системы. Планшет относят в термостат на сутки.

4. Определение вида выделенных микроорганизмов (4-ый день).

Через 24 часа оценивают результаты биохимической активности по изменению цвета индикатора в лунке и сопоставляют их с таблицами тест-системы. По результатам изучения свойств выделенных чистых культур определяют виды микроорганизмов, что является одной из конечных целей бактериологического метода диагностики. Используют определитель Берджи.

Результат оформляют в виде протокола исследования.

ПРОТОКОЛ ИССЛЕДОВАНИЯ.

9. Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний

Основным методом микробиологической диагностики и «золотым стандартом» микробиологии, является бактериологический метод.

Цель бактериологического метода заключается в выделении чистой культуры возбудителя заболевания из исследуемого материала, накопление чистой культуры и идентификация данной культуры по набору свойств: морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, антигенных, по наличию факторов патогенности, токсигенности и определение его чувствительности к антимикробным препаратам и бактериофагам.

Бактериологический метод исследования включает:

1. посев исследуемого материала в питательные среды

2. выделение чистой культуры

3. идентификацию микроорганизмов (определение принадлежности к виду).

Выделение и идентификация чистых культур аэробных и анаэробных бактерий предусматривает проведение следующих исследований:

I этап (работа с нативным материалом)

Цель: получение изолированных колоний

1. Предварительная микроскопия дает ориентировочное представление о микрофлоре

2. Подготовка материала к исследованию

3. Посев на плотные питательные среды для получения изолированных колоний

4. Инкубация при оптимальной температуре, чаще всего 37°С, в течение 18-24 часов

II этап

Цель: получение чистой культуры

1. Макроскопическое изучение колоний в проходящем и отраженном свете (характеристика величины, формы, цвета, прозрачности, консистенции, структуры, контура, поверхности колоний).

2. Микроскопическое изучение изолированных колоний

3. Постановка пробы на аэротолерантность (для подтверждения присутствия в исследуемом материале строгих анаэробов).

4. Посев колоний, характерных для определенного вида, на среды накопления чистой культуры или элективные среды и инкубация в оптимальных условиях.

III этап

Цель: идентификация выделенной чистой культуры

1. Для идентификации выделенной культуры по комплексу биологических свойств изучается:

морфология и тинкториальные свойства

культуральные свойства (характер роста на питательных средах)

биохимические свойства (ферментативная активность микроорганизмов)

серологические свойства (антигенные)

вирулентные свойства (способность к продукции факторов патогенности: токсины, ферменты, факторы защиты и аггресии)

патогенность для животных

фаголизабельность (чувствительность к диагностическим бактериофагам)

чувствительность к антибиотикам

другие индивидуальные свойства

IV этап (Заключение)

По изученным свойствам делают заключение о выделенной культуре

Первый этап исследований. Исследование патологического материала начинается с микроскопии. Микроскопия окрашенного нативного материала позволяет установить ориентировочно состав микробного пейзажа изучаемого объекта, некоторые морфологические особенности микроорганизмов. Результаты микроскопии нативного материала, во многом определяют ход дальнейшего исследования, впоследствии их сопоставляют с данными, полученными при посевах на питательные среды.

При достаточном содержании патогенных микроорганизмов в образце проводят посев на плотные питательные среды (для получения изолированных колоний). Если в исследуемом материале бактерий мало, то посев проводят на жидкие питательные среды обогащения. Питательные среды выбирают соответственно требовательности микроорганизмов.

Культивирование микроорганизмов возможно только при создании оптимальных условий их жизнедеятельности и соблюдении правил, исключающих контаминацию (случайное загрязнение посторонними микробами) исследуемого материала. Искусственные условия, которые исключили бы загрязнение культуры другими видами, можно создать в пробирке, колбе или чашке Петри. Вся посуда и питательные среды должны быть стерильными и после посева микробного материала защищены от загрязнения извне, что достигается с помощью пробок или металлических колпачков и крышек. Манипуляции с исследуемым материалом должны проводится в зоне пламени спиртовки для исключения контаминации материала из внешней среды, а также в целях соблюдения техники безопасности.

Посевы материала на питательные среды должны быть сделаны не позднее 2 часов с момента их забора.

Второй этап исследований. Изучение колоний и выделение чистых культур. Через сутки инкубации на чашках вырастают колонии, причем на первом штрихе рост сплошной, а на следующих – изолированными колониями. Колония – это скопление микробов одного вида, выросших из одной клетки. Таккак материал представляет собой чаще всего смесь микробов, то вырас­тает несколько видов колоний. Карандашом маркируют разные колонии,очерчивая их кружком со стороны дна, и изучают их (табл. 11). Прежде всего, изу­чают колонии невооруженным глазом: макроскопические признаки. Чашку просматривают (не открывая ее) со стороны дна в проходящем свете, отмечают прозрачность колоний (прозрачная, если не задерживает свет;полупрозрачная, если частично задерживает свет; непрозрачная, если свет через колонию не проходит), измеряют (в мм) размер колоний. Затем изучают колонии со стороны крышки, отмечают форму (правильная круглая, неправильная, плоская, выпуклая), характер поверхности (гладкая, блестящая, тусклая, шероховатая, морщинистая, влажная, сухая, слизистая), цвет (бесцветная, окрашенная).

Таблица 11. Схема изучения колоний

Примечание: 5-7 пункты изучаются при малом увеличении микроскопа.

Еще лучше можно увидеть различия колоний при рассмотрении их с увеличением. Для этого закрытую чашку дном кверху помещают на предметный столик, слегка опускают конденсор, используют неболь­шое увеличение объектива (х8), передвигая чашку, изучают у колоний микроскопические признаки: характер края (ровные, волнистые, зазубренные, фестончатые), структуру (гомогенная, зернистая, волокнистая, однородная, или различающаяся в центре и по периферии).

Далее изучают морфологию микробных клеток из колоний. Для это­го из части каждой из отмеченных колоний делают мазки, окрашивают по Граму. Во время взятия колоний обращают внимание на консистенцию (сухая, если колония крошится и берется с трудом; мягкая, если берется легко на петлю; слизистая, если колония тянется за петлей; твердая, если часть колонии не берется петлей, можно снять только всю колонию).

При просмотре мазков устанавливают, что колония представлена одним видом микроба, следовательно, могут быть выделены чистые куль­туры бактерий. Для этого из изученных колоний делают пересев на скошенный агар. При пересеве из колоний нужно тщательно следить, чтобы взять именно намеченные колонии, не задевая петлей близлежащих колоний. Пробирки подписывают и инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 24 часов.

Третий этап исследований. Идентификация выделенной культуры. Идентификация микробов – определение систематического поло­жения выделенной из материала культуры до вида и варианта. Первым условием надежности идентификации является безусловная чистота культуры. Для идентификации микробов используют комплекс признаков: морфологические (форма, размеры, наличие жгутиков, капсулы, спор, взаим­ного расположения в мазке), тинкториальные (отношение к окраске по Граму или другим методам), химические (соотношение гуанина+цитозина в молекуле ДНК), культуральные (питательные потребности, условия куль­тивирования, темп и характер роста на различных питательных средах), ферментативные (расщепление различных веществ с образованием про­межуточных и конечных продуктов), серологические (антигенная структура, специфичность), биологические (вирулентность для животных, токсигенность, аллергенность, влияние антибиотиков и др.).

Для биохимической дифференциации изучают способность бактерий сбраживать углеводы с образованием промежуточных и конечных продуктов, способность разлагать белки и пептоны и изучают окислительно-восстановительные ферменты.

Для изучения сахаролитических ферментов выделенные культуры засевают в пробирки с полужидкими средами, содержащими лактозу, глюкозу и другие углеводы и многоатомные спирты. На полужидкие среды посев делают уколом в глубину среды. При посеве уколом пробирку со средой держат под наклоном, вынимают проб­ку, обжигают край пробирки. Материал забирают стерильной петлей и прокалывают ею столбик питательной среды почти до дна.

Для определения протеолитических ферментов выделенную культуру засевают на пептонную воду или МПБ. Для этого в руку берут про­бирку с посевом ближе к себе, а пробирку со средой - дальше от себя. Обе пробирки открывают одномоментно, захватив их пробки мизинцем и краем ладони, обжигают края пробирок, прокаленной охлажденной петлей захватывают немного культуры и переносят во вторую пробирку, растирают в жидкой среде на стенке пробирки и смывают ее средой.

При посевах и пересевах внимание должно быть обращено на соблюдение правил стерильности, для того, чтобы не загрязнять свои посевы посторонней микрофлорой, а также не загрязнять окружающую среду. Пробирки маркируют и помещают в термостат для инкубирования при температуре 37°Сна сутки.

Заключение

Учет результатов. Заключение по исследованию. Учитывают результаты идентификации и по совокупности полученных данных, опираясь на классификацию и характеристику типовых штаммов, описанных в руководстве (определитель Берджи, 1994-1996 гг.), определяют вид выделенных культур.

Бактериологическое исследование - это исследование, предназначенное для выделения и изучения их свойств с целью постановки микробиологического диагноза.

Исследуемый материал следует брать в асептических условиях в стерильную посуду и доставлять в лабораторию возможно скорее. В случае необходимости пробы следует хранить на холоде. Методика взятия проб зависит от объекта, характера заболевания и свойств микроорганизма. Одним из распространенных приемов бактериологического исследования является бактериоскопия.

Для изучения нефиксированных бактерий пользуются двумя методами: раздавленной (между предметным и покровным стеклами) капли и . Следует помнить, что препараты нефиксированных бактерий заразны.

Для бактериоскопии фиксированных препаратов используют мазки. Для их приготовления каплю исследуемой жидкости распределяют по поверхности предметного стекла, а затем высушивают. Наиболее распространенным методом фиксации препарата является пронесение его через пламя газовой горелки. В некоторых случаях используют фиксирующие составы. Фиксированные препараты, как правило, окрашивают (см. Окраска микроорганизмов). К числу важнейших элементов бактериологического исследования относятся посевы и пересевы , производимые бактериальной петлей или пастеровской пипеткой. Петлю стерилизуют прокаливанием в пламени, затем ее остужают прикосновением к участку незасеянного агара или ополаскивая в стерильной жидкости. При использовании пастеровской пипетки ее кончик обламывают пинцетом, несколько раз проносят пипетку через пламя горелки и дают остыть. При посевах используют жидкие и твердые питательные среды. При посеве на скошенный агар культуру бактерий растирают петлей по поверхности агара. При посеве в толщу агарового или желатинового столбика питательную среду прокалывают до дна пробирки петлей или особой иглой. При посеве в жидкую среду надо следить, чтобы жидкость не выливалась и не смачивала края пробирок и пробки. Посевы и пересевы следует проводить вблизи пламени газовой горелки, пробирки не должны долго оставаться открытыми, петля или пастеровская пипетка с культурой не должна ни к чему прикасаться; перед тем как закрывать пробирку, края ее следует прожечь. Засеянные пробирки необходимо тотчас же надписать.

Важнейшим этапом бактериологического исследования является идентификация - определение видовой или типовой принадлежности бактерий, полученных в виде чистой культуры. При идентификации бактерий производится изучение их физиологических и биохимических свойств, токсинообразования. Широко используют серологические методы идентификации бактерий (реакции и ). Во многих случаях эффективным оказывается биологический метод идентификации микроорганизмов, основанный на заражении лабораторных животных исследуемым материалом или полученной культурой бактерий и выявлении у животных характерных патологических изменений.

Для выделения чистых культур используют механические и биологические методы. Пример механического метода: каплю исследуемого материала растирают одним и тем же стерильным шпателем или бактериальной петлей по поверхности плотной питательной среды, последовательно в первой, второй и третьей . Выделение чистой культуры производится из выросших отдельных колоний и заключается в их исследовании и отсеве на свежую питательную среду. Биологические методы выделения чистых культур основаны на учете того или иного свойства выделяемого микроба, отличающего его от других микробов, находящихся в исследуемом материале.

При биологическом методе используют такого рода питательные среды, в которых созданы условия, благоприятные для развития определенного вида микробов. К числу биологических методов относится также заражение лабораторных животных, чувствительных к выделяемому виду бактерий.

Бактериологическое исследование - комплекс методов для выявления патогенных микроорганизмов у больного, у носителя или на объектах внешней среды. Бактериологические исследования пользуются также для обнаружения условно патогенных и санитарно-показательных микробов, характеризующих степень загрязнения внешней среды, для изучения микробного пейзажа определенной среды (объекта). Бактериологическое исследование может быть использовано для диагностики, профилактики инфекционных заболеваний, для санитарно-гигиенической характеристики среды, окружающей человека, для научного исследования.

Материал и метод бактериологического исследования зависят от цели анализа, условий среды, патогенеза и течения заболевания. При наличии бактериемии микроб обнаруживают при помощи посева крови. В случаях выраженных местных поражений возбудителя следует искать в отделяемом или выделениях пораженного органа (дифтерия, дизентерия, гонорея и др.). Наконец, при заболеваниях со сложным течением, когда (как, например, при брюшном тифе) бактериемия сменяется поражениями тонких кишок, на каждом этапе применяют соответствующий метод исследования: в течение первой недели заболевания производят посев крови, на второй наиболее достоверно серологическое исследование, начиная с третьей недели положительный результат получают при посеве испражнений; последним методом пользуются и в качестве контрольного исследования для обнаружения бактерионосителей среди реконвалесцентов и для наблюдения за ними.

Выполнение любой из указанных задач осуществляют применением методов, предназначенных для выделения и определения микроорганизмов. В зависимости от характеристики микроба используют весь комплекс методов или его части.

Бактериоскопия - наиболее достунный прием, основанный на микроскопическом изучении материала. При микроскопии свежих препаратов можно пользоваться некоторыми микрохимическими реакциями (например, окраска йодофильных бактерий раствором Люголя) или избирательной окраской разных структурных частей бактерий.

Более четко бактерии можно выявить в окрашенном препарате. Исследуемый материал наносят на предметное стекло тонким и по возможности ровным слоем. Дают препарату высохнуть на воздухе и фиксируют одним из общепринятых методов, но чаще всего фламбированием, т. е. двух-, трехкратным быстрым проведением препарата над пламенем горелки так, чтобы стекло было теплое, но не горячее. Препарат, остуженный после фиксации, окрашивают простой или дифференциальной окраской (см. Окраска микроорганизмов). При флюоресцентной микроскопии используют как нативные, так и сухие препараты. В этом случае обработка определенными красителями вызывает свечение структур микробного тела или всего микроба в ультрафиолетовых или коротких синих лучах. В другой модификации микробов обрабатывают специфическими сыворотками, меченными флюоресцентами (красителями). Бактерии, соответствующие сыворотке, будут светиться, так как на них осядет меченая сыворотка. Гетерологичные бактерии не будут светиться.

Методом бактериоскопии широко пользуются для бактериологической диагностики некоторых инфекционных заболеваний (гонорея, туберкулез, возвратный тиф), а также при изучении всего комплекса микрофлоры органа (миндалины, влагалище), продукта или другого объекта.

Метод посева, т. е. выделение чистой культуры искомого микроорганизма, является более точным и надежным способом бактериологической диагностики, чем бактериоскопия. Свежий материал размазывают по поверхности плотной питательной среды, налитой в чашки Петри. Первичный посев производят на обычные среды, благоприятные для данного микроба, на дифференциальные или на селективные среды. Выбор питательной среды (см.), как и метода предварительной обработки свежего материала для посева, зависит от степени его загрязнения сопутствующей посторонней микрофлорой. Через 24-48 час. содержания в термостате при оптимальной для данного микроба температуре чашки рассматривают и подозрительные колонии пересевают на среды, способствующие размножению данного возбудителя. Таким образом получают культуру однородных бактерий, которые и должны быть идентифицированы.

Идентификация микроба начинается с изучения его морфологии в окрашенном препарате и в раздавленной капле (см.) для определения формы микробов и их подвижности. Следующим этапом является исследование ферментативной способности бактерий по расщеплению углеводов, аминокислот, мочевины в определенных для каждого вида сочетаниях. У бактерий наиболее изучены сахаро- и протеолитические ферменты.

Идентификация микроба должна быть дополнена изучением других свойств, характерных для каждого рода и вида микроорганизмов. К таким свойствам относится способность выборочно растворять эритроциты разных животных (гемолиз), свертывать плазму крови (плазмокоагуляция), растворять сгусток фибрина (фибринолиз) и пр. Все эти особенности бактерий могут быть использованы при их определении как дифференциальные признаки.

Окончательное определение микробов некоторых видов, в основном патогенных бактерий семейства кишечных, включает серологическую идентификацию (см. Идентификация микробов). Обычно для этого ставят реакцию агглютинации, т. е. выявляют скучивание бактерий под влиянием одноименной иммунной сыворотки. Агглютинация микробов в сыворотке против определенного вида указывает на принадлежность к этому виду. Обычно реакцию агглютинации ставят ориентировочно на стекле и для окончательного определения в пробирках с разведениями сыворотки.

Ряд микробов не удается определить до конца описанным путем. Тогда идентификацию необходимо дополнить заражением лабораторных животных, поскольку для некоторых бактерий характерна патогенность или токсигенность, выявляющаяся при заражении животных. В некоторых случаях заражение животных служит также методом накопления патогенных микробов.

Только сопоставление всех характеристик культуры, собранных при изучении морфологии, биохимических, серологических, а где нужно и биологических свойств ее, может дать основания для идентификации. Ответ при положительном результате исследования не представляет затруднений, если выделенный микроб типичен. В таком случае указывают род, вид и, если определялся, тип бактерии. При выделении микроба, отклоняющегося по каким-то свойствам от типичной характеристики, дается ответ с указанием на отклоняющийся признак. В таком случае полезно повторить исследование, если позволяет течение болезни или условия сбора материала. Полезно также подвергнуть культуру атипичных микробов дополнительному изучению другими, более сложными методами.

Отрицательные результаты бактериологического исследования имеют относительное значение и показывают лишь, что в исследованной порции материала искомые микробы не содержались или были нежизнеспособны. Однако они могут присутствовать в другой порции. По этому, например, при обследовании на бациллоносительство (брюшной тиф, дизентерия, дифтерия) требуется проводить повторные исследования.

Бактериологический метод исследования. Выделение чистой культуры аэробных бактерий (1-2 этапы)

1. Суть бактериологического метода

3. Методы получения изолированных колоний

4. Методы получения чистой культуры

1. Провести первичный посев методом Коха и Дригальского

2. Выделить чистую культуру

План работы:

1. Бактериологический метод исследования

2. Этапы бактериологического метода

3. Понятие: чистая культура, штамм, колония

4. Методы получения изолированных колоний

5. Методы получения чистой культуры аэробных бактерий

Основным методом лабораторной диагностики инфекционных болезней является бактериологический метод. Суть бактериологического метода заключается в выделении возбудителей из исследуемого материала и его идентификации (определения рода, вида, разновидностей).

Бактериологический метод позволяет определить:

1. Вид возбудителя и поставить диагноз заболевания

2. Антибиотики, убивающие возбудителя и назначить соответствующее лечение

3. Фаговары и серовары возбудителя для выявления источника инфекции

Первый этап - первичный посев исследуемого материала для получения изолированных колоний. Первичный посев проводят на накопительные среды и ДДС (чашечные среды).

Второй этап - характеристика изолированных колоний и получение из них чистой культуры путем пересева на скошенный столбик основной среды.

Третий этап - идентификация чистой культуры - определение рода, вида, разновидностей возбудителя, определение антибиотикочувствительности, определение фаговаров.

Культура микроорганизмов - это бактерии, выросшие на питательных средах. Чистая культура - это бактерии одного вида, выросшие на питательных средах. Внутри вида встречаются разновидности, отличающиеся по одному признаку:

1. Морфовары - отличаются по морфологии

2. Хемовары - отличаются по биохимическим свойствам

3. Серовары - отличаются по антигенным свойствам

4. Фаговары - отличаются по чувствительности к фагам

Чистая культура необходима для проведения идентификации, определения сероваров, фаговаров, чувствительности к антибиотикам. Штамм - это бактерии одного вида, выделенные из конкретного источника (река Волга, больной Иванов и т. д.). Колония - видимое скопление бактерий одного вида, образующееся при размножении одной бактериальной клетки на плотной питательной среде.

Первый этап исследования - первичный посев исследуемого материала для получения изолированных колоний. Перед первичным посевом проводят микроскопию исследуемого материала. Исследуемый материал как правило содержит смесь различных бактерий, в том числе и возбудителей болезни. Для выделения возбудителя необходимо получить изолированные колонии (бактерии одного вида) путем подбора питательной среды и специальными методами посева.

Существует два метода получения изолированных колоний:

1. Метод Дригальского